紫外线照射：一种整合游离型基因阵列的方法

摘要

来源：Mariol, M. C 等. 一种将高传递率附加体阵列快速整合到C. elegans基因组中的方法。JoVE实验视频杂志 (2013)。

C. elegans 转基因通常通过显微注射实现，通常会产生带有大型染色体外阵列的品系，导致转基因的表达和遗传具有变异性。紫外线照射可诱导该阵列整合到染色体中，从而实现更稳定的转基因遗传。

方案

本方案摘自Mariol 等 一种快速整合具有高传递率的染色体外阵列的方案 秀丽隐杆线虫 基因组, J. Vis. Exp. (2013).

1. 转基因线虫的紫外照射与恢复

1. 线虫辐照：
   1. 将30-100条荧光转基因L4期线虫分别挑取至不同的培养板上（每板15-20条）。
   2. 将培养板去盖后放入紫外交联仪中，以0.012 J/cm²剂量辐照线虫。需注意不同品系对紫外光的敏感性存在差异，且结果可能因所用紫外辐照仪的不同而有所变化。可尝试使用0.010-0.015 J/cm²范围内的剂量。
2. 辐照后线虫恢复：
   1. 将含有辐照线虫的培养板置于15 °C过夜，以供恢复。
   2. 检查存活线虫数量。在我们的实验条件下，约80-90%的存活率表明辐照效果良好。
   3. 将辐照后的线虫在15-25 °C下继续培养，直至其子代发育至可观察共注射标记表达的阶段。

2. 转基因整合株系的分离

1. 选择F1代动物：
   1. 将单个150–200只具有荧光的F1代动物分别转移到独立的培养板上。对于转基因传递率较高的品系（≥80%），100只F1代动物已足够。
   2. 将这些F1代培养板置于15–25 °C条件下培养，直至其子代发育至适合观察荧光F2代动物的阶段。
   3. 弃去所有出现以下情况的F1代培养板：i) 无子代产生，表明该F1代动物不育或已死亡；或 ii) 无荧光或仅有极少数荧光F2代动物，表明该F1代动物未按预期频率传递转基因。此步骤操作迅速，相较于标准方案中需估算荧光F2代线虫比例以筛选出荧光子代≥75%的F1代培养板的方法，具有明显优势（表1）。
2. 选择F2代动物：
   1. 从每个选定的F1代培养板中挑取四只具有荧光的转基因F2代动物。若使用荧光转基因标记（例如mCherry、gfp或dsRed），应优先挑选荧光强度较高的F2代线虫，因其可能为整合阵列的纯合子。注意在挑取F2代动物时，必须避免携带卵或幼虫，以防在下一步中出现假阴性结果。
   2. 将F2代动物在15–25 °C条件下培养。
3. 整合型转基因品系的分离与验证：
   1. 对F2代培养板进行筛选，寻找F3代线虫全部具有荧光的培养板。该筛选过程较快，因为只要发现一只非荧光线虫，即可丢弃该培养板。一个对整合转基因呈纯合状态的F2代动物，其子代将100%为荧光纯合子。
   2. 从选定的培养板中分别挑取八只荧光F3代动物，以确认转基因的100%遗传率。理论上，此步骤仅需挑取一只动物即可。然而，为避免因辐射随机诱导影响线虫生理功能的重要基因突变而导致选到不育或健康状况不佳的个体，建议挑取八只荧光F3代动物。
   3. 如有可能，应保留多个独立的整合型转基因品系，i.e. 来自不同F1代动物的品系。

结果

表 1. 标准方案与改进方案在将染色体外阵列整合到 C. elegans 基因组中的比较。 两个非整合型转基因以大致相同的传递频率分别使用标准方案或改进方案进行整合。主要区别在于：在标准方案中，需对所有 F1 平板上的后代进行筛选，以估算转基因 F2 蠕虫的比例，该比例应 ≥ 75%。此步骤耗时较长，特别是当初始传递率接近 75% 时。而在改进方案中，只需从每个携带转基因 F2 动物的 F1 平板中挑取四只 F2 蠕虫，并对其后代（F3）进行筛选，确认是否达到 100% 的转基因蠕虫比例，该步骤可快速完成。本实验对标准方案进行了优化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
紫外交联仪	Fischer Scientific		波长 254 nm
体视显微镜 SteREO Discovery V8	Carl Zeiss, Inc.
培养皿，60 mm	CML	BPS55E6
铂金丝 0.25 mm	Alfa Aesar	6/4/7440	用于制作挑虫用的挑针